Кинетика ферментативных реакций: уравнение Михаэлиса–Ментена и линеаризация Лайнуивера–Берка

Краткое описание строения и свойств ферментов

Ферменты, или энзимы — это чаще всего молекулы белковой природы, катализирующие химические реакции в живых системах. Кроме белков, существует немногочисленная группа РНК ферментов. 

Как и все белки, ферменты синтезируются изначально в виде полипептидной цепочки — первичная структура. Потом за счёт образования водородных связей и дисульфидных мостиков между между молекулами аминокислот в цепи образуется вторичная структура фермента. В дальнейшем под действием Ван-Вер-Вальсовых, электростатических и нековалентных сил образуется третичная и четвертичная структуры ферментов. 

В каталитическом процессе участвует не весь фермент, а только его малая часть — активный центр. 

Кроме этого стоит понимать, что любой фермент обладает высокой специфичностью и активностью. Для того чтобы катализировать реакцию, фермент связывается только с одним или несколькими определёнными субстратами. Большинство ферментативных процессов идёт со скоростями в 10⁸-10²⁰ раз большими, чем если бы они протекали сами. Говоря об активности ферментов, то их эффективность как катализаторов зачастую выше в 10⁸-10⁹ раз, чем их неорганические аналоги. 

Кинетика ферментативных процессов

В основе кинетического анализа ферментативного процесса лежит предположение о том, что между ферментом (E) и субстратом (S) происходит обратимое образование фермент-субстратного комплекса. В дальнейшем в результате протекания реакции субстрат необратимо преобразуется в продукт (P) и комплекс распадается.

Используя допущение о стационарном протекании реакции, применим метод квазистационарных концентраций для фермент-субстратного комплекса.

Учтём тот факт, что фермент при реакции находится как в свободной форме, так и в форме фермент-субстратного комплекса. Выразим тогда его свободную форму и подставим в квазистационарное уравнение. 

Выразим из этого уравнения [ES].

Скорость ферментативной реакции в основном определяется скоростью образования продукта реакции из субстрат ферментного комплекса. Тогда:

Разделим в получившемся уравнении и числитель, и знаменатель на K₁ и получим:

K_M — это константа Михаэлиса, показывающая концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной. Численное значение K_M зависит от многих параметров:

• pH среды, где протекает реакции;
• Температуры, при которой проводится реакция;
• Концентрации реагента, который подвергается ферментативному преобразованию;
• Концентрация продукта ферментирования; 
• Наличию или отсутствию активаторов/ингибиторов ферментов

В результате действиях всех этих факторов K_M может меняться в приделах от 1 до 10^-8 моль*л^-1. Стоит также отметить, что чем меньше значение K_M, тем больше сродство фермента к субстрату, и наоборот. Кроме этого, ферментативные реакции часто проводят в буферных растворах с контролируемой ионной силой, чтобы избежать изменения K_M (это можно прочитать в конспекте Гусаровой А.Р. «Расчёт осмотического давления и других коллигативных свойств растворов»).

На начальных этапах, когда количество субстрата превышает количество фермента, а концентрация продукта стремиться к нулю, уменьшением концентрации субстрата можно пренебречь. Тогда:

Если же K₂>>K₃, то в начале реакции устанавливается квазистатическое равновесие и константа Михаэлиса заменяется на субстратную константу (K_S). 

Проанализируем уравнение для v₀ с K_M для двух предельных случаев:

• [S]₀ << K_M, тогда реакция имеет первый порядок как по ферменту, так и по субстрату;
  
• [S]₀ >> K_M, в этом случае начальная скорость реакции не зависит от концентрации субстрата и называется максимальной скоростью ферментативной реакции v_max .Этот эффект так называемого субстратного насыщения обусловлен практически полным связыванием всего имеющегося в системе фермента в фермент-субстратный комплекс, поэтому его концентрация, а, следовательно, и наблюдаемая скорость реакции перестают зависеть от концентрации субстрата. Тогда 
  
  

Это уравнение было получено Бриггсом и Холдейном в 1925 г., но названо ими уравнением Михаэлиса−Ментена. На практике же, невозможно никогда достичь v_max, так как работа фермента очень сильно зависит и от концентрации продукта реакции. Чем больше концентрация продукта, тем меньше сродство фермента к субстрату. Следует также помнить, что начальная скорость ферментативной реакции часто определяется по оптической плотности (это можно прочитать в конспекте Борисова В.В. «Построение градуировочного графика в спектрофотометрии и его статистическая обработка»).

На рисунке представлена зависимость начальной скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата.

Стоит обратить внимание, что построение такого графика для определения v_max и K_M на практике очень сложно. Поэтому для определения K_M и v_max графически используют преобразованное уравнение Михаэлиса-Ментена, предложенное Г.Лайнуивером и Д.Бэрком для линеаризации графика.

Графическое определение K_M и v_max в координатах Лайнуивера-Берка

Максимальную скорость можно определить по отрезку, отсекаемому на оси ординат, 1/v_max , а константу Михаэлиса можно вычислить либо по тангенсу угла наклона прямой, равному K_M/v_max , либо по отрицательному отрезку, отсекаемому на оси абсцисс.

Недостатки модели Михаэлиса

Несмотря на способность модели Михаэлиса-Ментена к упрощению анализа ферментативных процессов, её применение сопряжено с рядом методологических и практических ограничений.

• Уравнение можно применять только при стационарных условиях;
• Недопущение наличия продуктов ферментативной реакции в начальной системе;
• Не подходит для определения скорости реакции в реакциях с аллостерическими ферментами.

Заключение и выводы

• Ферменты — это сложные белковые молекулы, представляющие из себя биокатализаторы;
• Константа Михаэлиса — это константа, показывающая концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной;
• Уравнением Михаэлиса−Ментена имеет очень много допущений, вследствие чего теоретические значения, полученные при расчёте, могут сильно отличаться от полученных экспериментально;
• График получаемый при решении уравнения Михаэлиса−Ментена очень сложен для определения K_M и v_max на практике, поэтому используют линеаризированное уравнение, предложенное Г.Лайнуивером и Д.Бэрком. 

Пример решения задачи на уравнение Михаэлиса-Ментена

Фермент катализирует превращение субстрата S в продукт P по кинетике Михаэлиса–Ментена. При V_max = 120 нмоль/мин и K_M = 30 мкМ найдите начальную скорость реакции при концентрациях субстрата:

• [S]₀ = 3 мкМ;
• [S]₀ = 30 мкМ;
• [S]₀ = 300 мкМ;

Решение задачи

Воспользуемся уравнением Михаэлиса-Ментена и подставим известные нам величины:

• V₀₁=120*3/(30 + 3) = 360 / 33 ≈ 10.91 нмоль/мин;
• V₀₂=120 · 30 / (30 + 30) = 3600 / 60 = 60 нмоль/мин;
• V₀₃=120 · 300 / (30 + 300) = 36000 / 330 ≈ 109.09 нмоль/мин;

Комментарий

Следует помнить, что при [S]₀ ≪ Km начальная скорость пропорциональна [S]; при [S]₀ = Km начальная скорость равна половине V_max; при [S]₀ ≫ Km начальная скорость стремится к Vmax.